Hibridizacija in situ je metoda za odkrivanje kromosomskih aberacij. Vključuje označevanje kromosomi s flouroscentom barvila in jih veže na sondo DNA. Ta tehnika se uporablja za prenatalno diagnozo genskih mutacij.
Kaj je hibridizacija in situ?
Hibridizacija in situ vključuje specifično označevanje kromosomi s flouroscentom barvila in jih veže na sondo DNA. Ta tehnika se uporablja za prenatalno diagnozo gen mutacije. In situ hibridizacija oz fluorescenčna hibridizacija in situ vključuje molekularno genetsko odkrivanje nukleinska kislina iz RNA ali DNA v določenih tkivih ali celicah. Običajno se ta vrsta diagnostike uporablja za odkrivanje strukturne ali numerične kromosomske nepravilnosti v nosečnost. V ta namen se uporablja umetno proizvedena sonda, ki je sama sestavljena iz nukleinske kisline. Nato se veže na nukleinska kislina v organizmu s parjenjem baz. Na to vezavo se nanaša izraz hibridizacija. Odkrivanje se izvede na živi strukturi pacienta in zato ustreza detekciji in situ. Od tega se ločijo metode in vitro, pri katerih zaznavanje poteka v epruveti. Metodo so v 20. stoletju razvili znanstveniki Joe Gall in Mary Lou Pardue. Od takrat se je tehnika razvijala. Na primer, medtem ko so bile takrat uporabljene radioaktivne sonde, so sove, označene s flouroscenco, s kovalentno vezjo na označevanje molekule se uporabljajo danes.
Funkcija, učinek in cilji
Hibridizacija in situ se običajno uporablja za odkrivanje kromosomskih aberacij, kromosomskih nepravilnosti, ki jih na kariogramu ni mogoče zaznati. Tako se metoda vedno uporablja, kadar je treba med nosečnost. Ker so kromosomske aberacije problem, ki ga danes ne smemo podcenjevati, se je uporaba metode sčasoma povečala. Hibridizacija se opravi z uporabo maternih celic iz matere plodovnica. Osnova tehnike je vezava barvno označene sonde na fragmente DNA. Zahvaljujoč vezavi lahko kasneje z mikroskopom ocenimo število kopij, saj posamezne kopije oddajajo svetlobni signal in so tako vidne pod mikroskopom. Za to obstajajo različni postopki. Analiza se izvede takoj po vezavi. V tem primeru je flouroscenčno barvilo, kot je biotin ki se veže neposredno na sondo DNA. Pri posredni metodi hibridizacije in situ analize ni mogoče izvesti takoj po hibridizaciji, ker se lahko fluorescentne snovi na sondo vežejo šele po hibridizaciji. Ta posredna metoda se pogosteje uporablja kot neposredna, ker velja za bolj občutljivo. Tehnike vključujejo kromosomsko specifične centrometerske DNK-sonde, locus-specifične DNA-sonde, kromosomsko-specifične DNA-knjižnične sonde in primerjalne hibridizacije genoma. Za odkrivanje kromosomskih numeričnih nepravilnosti se lahko uporabljajo sonde centromerne DNA, specifične za kromosome. To pomeni, da se v glavnem uporabljajo, če se podvojijo ali izbrišejo kromosomi sumijo. Locus-specifične sonde DNA so primerne predvsem za odkrivanje minimalnih mutacij, ki jih v kariogramu ni mogoče zaznati. Sonda knjižnice DNA, specifična za kromosom, se uporablja zlasti za odkrivanje vstavkov in premestitev. Primerjalna hibridizacija genoma pa je celovita analiza izgub in dobičkov v kromosomskem materialu. Danes je hibridizacija in situ zelo pomembna pri diagnostiki različnih kromosomskih mutacij. V diagnostiki Downov sindromna primer, sonde se vežejo na kromosom 21. V ta namen se običajno uporabljajo sonde, specifične za kromosome, ki jih lahko uporabimo v primeru suma na to bolezen. Sum se lahko pojavi na primer, če so starši že rodili otroka z boleznijo in boleznijo ultrazvok slika je opazna. Če gre za trojno in ne za dvojno kravato, ki povzroči trojni barvni signal, se diagnoza šteje za potrjeno.
Tveganja, neželeni učinki in nevarnosti
Za razliko od PCR je na primer hibridizacija in situ veliko manj dovzetna za kontaminacijo. Poleg tega je čas, potreben za postopek, izjemno manjši, vendar ker zarodki zlasti tvorijo kromosomske vzorce, nobenega prisotnega vzorca ni mogoče uporabiti za to, da bi z gotovostjo sklepali na preostanek kromosomskih vzorcev. distribucija in s tem genetski status drugih celic. Barvni signali se lahko prekrivajo ali ostanejo nevidni iz drugih razlogov. Tako hibridizacija in situ kot diagnostično orodje med nosečnost je razmeroma nagnjen k napakam. Lahko se pojavijo napačne diagnoze in starši se lahko odločijo proti zdravemu zarodkov. Da bi zmanjšali nagnjenost hibridizacije in situ, je treba hkrati pregledati vsaj dve embrionalni celici. Z vzporednim pregledovanjem dveh celic obstaja zdaj le zanemarljivo tveganje za napačno diagnozo. Starši se torej lahko v takem primeru zanesejo na diagnozo. Hibridizacija in situ ni na voljo vsaki nosečnici, temveč le ženskam iz rizične skupine. Kljub temu nosečnicam tovrstne diagnoze na lastno zahtevo ne zavrnejo. Nenormalno ultrazvok ugotovitve ali nenormalni serum lahko zdravnika pozovejo, da ponudi diagnostični postopek. Danes lahko s hibridizacijo in situ diagnosticiramo velik delež kromosomskih aberacij, nikakor pa ne vseh. Zato hibridizacije in situ nikoli ne smemo izvajati samostojno, ampak jo moramo vedno uporabljati skupaj s konvencionalnim kromosomskim testom. Nega nosečnice ima pri tem postopku glavno vlogo. Zato se pred analizo z bodočo materjo temeljito pogovori o diagnostični metodi in jo seznani s tveganji, možnostmi in omejitvami tehnike.
