Verižna reakcija s polimerazo predstavlja postopek iz molekularne biologije, ki podvaja odseke iz genskega materiala (deoksiribonukleinska kislina, DNA). Iz majhnih količin DNA nastanejo milijoni enakih kopij. Na ta način so na voljo količine, ki zadostujejo za različne preiskave.
Kaj je verižna reakcija polimeraze?
Verižna reakcija s polimerazo predstavlja metodo iz molekularne biologije, ki podvaja odseke iz genskega materiala (deoksiribonukleinska kislina, DNA). Izraz verižna reakcija polimeraze (PCR) opisuje reakcijo in vitro (latinsko: v kozarcu) s pomočjo encima, polimeraze (DNA polimeraze), kar vodi do podvajanja nekaterih gen zaporedja. Produkt reakcije je tudi izhodišče za nov cikel te reakcije. Število molekule podvoji in hkrati služi kot predloga za nov cikel. To se imenuje eksponentno množenje. Poteka v laboratoriju z veliko hitrostjo nekaj minut, podobno kot verižna reakcija. Ta laboratorijski postopek posnema podvajanje genskih informacij (DNA), ki se pojavi v naravnih pogojih med razmnoževanjem. Ameriški kemik KB Mullis velja za odkritelja tega procesa. Leta 1983 je predstavil ta postopek sinteze DNK in deset let kasneje prejel Nobelovo nagrado za kemijo.
Funkcija, učinek in cilji
V živih organizmih DNK v kromosomi ima dolžino, ki je ni mogoče povečati s pomočjo PCR. Namesto tega se uporablja za razširitev določenega odseka. To so lahko geni, določen del a genali regije, ki niso prepisane v beljakovin, tj. nekodirajo. Ti odseki običajno vsebujejo največ tri tisoč baznih parov v primerjavi s približno dvakrat tremi milijardami baznih parov na niz kromosomi pri ljudeh. Verižna reakcija polimeraze zahteva eno- ali dvoverižno verigo DNA, katere struktura mora biti vsaj delno znana. Poleg encima, polimeraze, se uporabljata še dva primerja. To so gradniki DNK, ki delujejo kot začetna in končna točka. Zanje je značilno zaporedje, ki se natančno ujema z regijo, ki jo je treba ojačati. V laboratoriju se verižna reakcija polimeraze izvaja v programabilnem ogrevalnem bloku. Potrebne komponente, kot so polimeraza, temeljni premaz, gradniki za gradnjo novega pramena (deoksiribonukleozidni trifosfati) in magnezijev ioni se seštevajo v puferski raztopini. Temperaturno-časovni program za reakcijo se začne z denaturacijo pri temperaturi nad 94 ° C. V tem postopku se dvoverižna DNA cepi in je prisotna v enoverižni obliki. V naslednjem koraku je pri približno 70 ° C temeljni premaz vezan na gen zaporedje in tvori izhodišče za encimsko reakcijo. Od tu polimeraza sintetizira komplementarno verigo. Nato se začne nov cikel, ki je spet sestavljen iz treh korakov denaturacije, vezave prajmerjev in sinteze verige DNA. Verižna reakcija s polimerazo se uporablja v sodni medicini, klinični diagnostiki in kliničnih raziskavah. V forenzični znanosti se DNK črpa iz koža, slina, lasje, seme oz kri s prizorišč zločina in po okrepitvi primerja z znanimi vzorci in se uporablja za identifikacijo določenih posameznikov. Z uporabo tega genetskega prstnega odtisa lahko očetovstvo razjasnimo tudi s spremenjenim pristopom. Pri razjasnjevanju bolezni se verižna reakcija s polimerazo uporablja za preverjanje vpletenih genov. Nekatere bakterijske bolezni lahko razvrstimo s prepoznavanjem določenih zaporedij. Virusne bolezni lahko označimo, ko se virusna DNA ali RNA transformira in ojača. V kri presejanje, je mogoče zaznati hepatitis ali s HIV posredovane bolezni v zelo zgodnji fazi. Pri diagnostiki tumorjev se uporablja za identifikacijo tumorskih celic. To omogoča razvrstitev tumorja, oceno poteka bolezni in uspešnosti terapija in napoved. V raziskavah se verižna reakcija s polimerazo uporablja za identifikacijo genov, povezanih z različnimi boleznimi. Za kloniranje genov, ki ni enako kloniranju organizma, se gen ojača, preden se v vektorju prenese v druge organizme (latinsko: popotnik, nosilec ). Ti lahko delujejo kot vzorci za boljše preučevanje bolezni ali njihovo produkcijo beljakovin ki se lahko uporablja kot droge.
Tveganja in nevarnosti
Verižna reakcija s polimerazo ima velik potencial pri odkrivanju majhnih količin DNA. Da bi izkoristili številne možnosti in se zaščitili pred pomembnimi napakami, je treba upoštevati nekatere predpogoje in različne vire napak. Ojačati je mogoče le odseke genskega materiala, katerih zaporedje je vsaj delno znano. Popolnoma neznanih zaporedij s to metodo ni mogoče ojačati. Izdelke ojačevalnika lahko nato vizualiziramo. Če pričakovani signal ni viden, je kljub prisotnosti iskanega zaporedja prisoten lažno negativen rezultat. Najpogosteje je to posledica neoptimiziranih ali slabo optimiziranih reakcijskih pogojev. Te je treba določiti kot funkcijo ciljnega zaporedja. V ta namen se preskušajo različni temperaturni in časovni profili, zaporedja in količine primerjev ter koncentracije drugih snovi v reakcijski zmesi. Lažno pozitivni rezultati se prikažejo kot signali, ki jih ni mogoče dodeliti želenemu izdelku. Večje težave povzročajo onesnaženja z DNK, ki izvirajo iz raziskovalca ali iz vira, ki ni tisti, ki ga je treba analizirati. DNA bakterijskega izvora vpliva tudi na rezultat verižne reakcije s polimerazo. Z nošenjem rokavic in previdnostjo je mogoče preprečiti takšne napake in oblikovati zanesljive sklepe o ojačanih izdelkih.
