Kaj je test PCR?
PCR test je laboratorijska metoda, ki se uporablja v molekularni biologiji in medicini. Test se uporablja za neposredno odkrivanje – in karakterizacijo – genskega materiala. Metoda PCR je po mnenju strokovnjakov enostavna za izvedbo, univerzalno uporabna in robustna.
V laboratoriju je test PCR sestavljen iz dveh korakov. V prvem koraku se obstoječi genski material pomnoži z verižno reakcijo s polimerazo (PCR). To omogoča pregled najmanjših sledi DNK. To je tudi razlog, zakaj PCR testi reagirajo tako občutljivo.
V drugem koraku se genetski material loči glede na njegove lastnosti, »razvrsti« in tako karakterizira. Z drugimi besedami, določena je fina struktura DNK.
Možnih aplikacij je veliko: zdravniki uporabljajo test PCR na primer za pregled brisov na prisotnost koronavirusov, krvodajalstvo za HIV ali za presejanje novorojenčkov glede morebitnih dednih bolezni. Bakterijske okužbe – na primer s povzročiteljem tuberkuloze – ali parazitske okužbe (malarija) je mogoče razjasniti tudi s PCR.
Pomagajo tudi pri obsodbi storilcev v sodni medicini na podlagi njihovih genetskih prstnih odtisov ali pa se uporabljajo kot testi očetovstva.
Koliko časa velja PCR test?
Rezultat PCR testa je običajno veljaven 48 ur od odvzema vzorca.
Kako zanesljiv je PCR test?
PCR je preizkušena metoda odkrivanja v molekularni diagnostiki in medicini. Velja za tako imenovani zlati standard z zelo nizko stopnjo napak. Za teste je značilna predvsem zelo visoka občutljivost in specifičnost.
Občutljivost pomeni zanesljivost, s katero test najde genetski material, ki ga je treba zaznati.
Specifičnost pomeni gotovost, s katero test ugotovi, da zadevni genski material ni prisoten v vzorcu.
Kdaj PCR testi delujejo pri okužbi s Sars-CoV-2?
PCR test praviloma zazna koronsko okužbo dva do tri dni pred in do 20 dni po pojavu simptomov. Tudi pri okuženih ljudeh, ki ostanejo popolnoma brez simptomov, je test učinkovit v kritičnem časovnem oknu, ko lahko okužijo druge.
V posameznih primerih je odkritje možno celo 60 dni po pojavu simptomov.
Možni viri napak
Stopnja napak pri procesu kopiranja DNK je v praksi zanemarljiva. Čeprav polimeraze DNA niso nikoli brez napak, skoraj nimajo vloge v postopku testiranja PCR.
V praksi so morebitni viri napak bolj v odvzemu vzorcev: zato je pomembno, da brise opravijo usposobljeni zdravstveni delavci. Vzorci sline in grgranja bi lahko zmanjšali točnost testa, saj se tu pojavijo učinki redčenja.
Kako poteka PCR test?
Test PCR opravi na primer družinski zdravnik ali v posebnih testnih centrih. Najprej zdravniki ali usposobljeni zdravstveni delavci vzamejo vzorec. Za preiskavo se običajno vzame bris iz zgornjih dihalnih poti. To je običajno v obliki brisa ust ali nazofarinksa.
Možno je tudi grgranje raztopine za izpiranje. Vzorec krvi je netipičen za odkrivanje korone – vendar se pogosto uporablja na primer pri pregledu novorojenčkov.
Ne glede na vrsto odvzetega vzorca se genetski material nahaja na vatirani palčki, v raztopini za izpiranje ali v kapljici krvi. Ta vzorčni material se pošlje v laboratorij, kjer se izolira in prečisti.
Test PCR je nato razdeljen na dva koraka:
- PCR: V tem koraku se poveča količina začetnega genskega materiala.
1. korak: PCR – "verižna reakcija s polimerazo"
»PCR« je prvi od dveh korakov: tu se pomnoži količina razpoložljive začetne DNK. Genski material je namreč mogoče analizirati šele, ko je na voljo v zadostnih količinah. V večini primerov je to človeška DNK; v primeru testov na koronavirus je to virusna RNA.
Okrajšava PCR pomeni "verižna reakcija s polimerazo".
Kaj je potrebno za PCR?
Začetno DNK damo v reakcijsko posodo s posebnimi snovmi. Obstoječi genetski material služi kot predloga, ki se kopira ob prisotnosti določenih encimov (Taq polimeraza) in določenih osnovnih gradnikov DNK.
Postopek kopiranja poteka v več ponavljajočih se vožnjah (ciklih).
Natančneje, skupaj se dodajo naslednje snovi:
- Začetna DNK: vzorčni material, ki ga je treba kopirati.
- Osnovni gradniki DNK: To so nukleobaze adenin, timin, citozin in gvanin.
- DNA polimeraza: Encim, ki povezuje posamezne gradnike DNK v dobro definirano verigo DNK. Na novo pridobljeni pramen je zrcalna slika (komplementarna) prvotnega izhodnega materiala.
- Primeri: Sestavljeni so iz 16 do 24 baznih parov in služijo kot začetni položaj in startni signal. Primerji pokažejo DNK polimerazi, na katerem mestu (začetne DNK) se začne proces kopiranja.
Kako poteka PCR test?
Zdaj, ko so v reakcijski posodi prisotne vse snovi, potrebne za PCR, se lahko začne dejanski proces kopiranja genskega materiala. To se zažene, krmili in ponovno ustavi izključno s temperaturo.
Reakcijsko posodo zato eno za drugo segrevamo ali ohlajamo na različne temperature. To se naredi s posebno napravo, znano kot termični cikel. Celotna reakcija traja približno eno do dve uri.
Posamezni koraki cikla PCR so
- Denaturacija dvojnih verig DNK: vzorec segrejemo na približno 90 stopinj Celzija. To loči prvotno dvojno verigo DNK na dve posamezni (komplementarni) enojni verigi.
- Pritrditev temeljnih premazov: Temperaturo znižamo na malo pod 60 stopinj Celzija. To povzroči, da se primerji (napredni začetni, povratni začetni) pritrdijo na določene položaje na ustreznih posameznih verigah DNA.
Po zaključenem ciklu se temperatura ponovno dvigne na približno 90 stopinj Celzija – cikel se začne znova od začetka.
Metodo PCR je mogoče uporabiti za pomnoževanje zaporedij DNK do približno treh kilobaznih parov (kbp). To ustreza približno 3,000 osnovnim gradnikom DNK, ki so povezani v "verigo". Za primerjavo: človeški genom shranjuje načrte in informacije za delovanje celice v okoli treh milijardah baznih parov – genom koronavirusa pa je sestavljen iz 30,000 baznih parov. S testom PCR je torej mogoče pomnožiti in pregledati samo kratke dele celotne DNK.
Primerji so ključnega pomena
Izbira primerjev je ključnega pomena za postopek PCR. Pri diagnostiki Sars-CoV-2 se na primer uporablja več primerjev (multiplex PCR).
Corona PCR testi tako iščejo tri različne virusne gene: To poveča splošno specifičnost na skoraj 99.99 %. To pomeni, da je pri tej visoki stopnji zadetkov le en lažno pozitiven test na 10,000 testov (če so vzorci pravilno odvzeti).
Koliko kopiranega genskega materiala je zdaj na voljo?
Predpostavimo, da sta po prvem ciklu prisotni dve enaki dvojni verigi DNK.
Po vsakem ciklu se količina (kopiranega) genskega materiala podvoji. Količina DNK torej eksponentno raste.
Zdravniki običajno ta postopek ponovijo približno dvajset do tridesetkrat.
Slikovito povedano to pomeni, da tudi če se v vzorcu na začetku nahaja samo ena dvojna veriga DNK, je po dvajsetih ciklih v reakcijski posodi že milijon enakih kopij.
Kaj pomeni vrednost Ct?
Število ciklov PCR je označeno v obliki tako imenovane vrednosti Ct. "Ct" izhaja iz angleškega izraza "cycle threshold". Ta vrednost Ct omogoča podajanje izjav o količini iskanega genskega materiala.
Z nizko vrednostjo Ct 20 je začetnega genskega materiala veliko. Če pa je vrednost Ct visoka – okoli 30 ciklov – je ustrezno malo DNK. Zato je treba cikel PCR izvajati pogosteje.
2. korak: elektroforeza "Razvrščanje po velikosti"
Ko je na voljo dovolj "obogatenega" genskega materiala, se lahko izvede elektroforeza. V tem procesu znanstveniki izkoriščajo specifično lastnost DNK: njen električni naboj.
Posamezni gradniki DNK so med seboj povezani preko (negativno) nabitega sladkorno-fosfatnega ogrodja. Daljše ko je določeno zaporedje DNK, večji je njegov električni naboj.
To omogoča pregled in karakterizacijo genetskega materiala. V praksi se neznani vzorec običajno nariše proti znanemu referenčnemu na »štartni črti« in po določenem času primerja med seboj.
Če je "hitrost migracije" enaka za obe sekvenci, to pomeni, da je zaznava najverjetneje pozitivna: Zaznava je zelo verjetno pozitivna – gen, ki ga iščete, je v vzorcu.
Poseben primer koronavirusa: priprava vzorca in RT-PCR
Odkritje koronavirusa je poseben primer. Sars-CoV-2 je eden od tako imenovanih RNA virusov. To pomeni, da je genetski material Sars-CoV-2 prisoten v obliki RNK (ribonukleinske kisline).
RNK se od DNK razlikuje le v nekaj pogledih. Med drugim je prisoten kot ena veriga in temelji na sladkorni ribozi namesto na 2'-deoksiribozi. Tudi nukleobazo timin nadomesti uracil kot četrta baza.
To virusno RNK je treba "prepisati" v DNK pred običajnim testom PCR. Ta proces se imenuje reverzna transkripcija (RT) – od tod tudi izraz RT-PCR. Kot del tega postopka se pridobi ena sama veriga cDNA ("komplementarna DNA"). V nadaljnjem koraku se ena veriga cDNA dopolni z drugo verigo DNA v zrcalni sliki.
Koliko časa traja, da pride do rezultata?
Ko je vzorec poslan v laboratorij, boste običajno prejeli rezultat v enem ali dveh delovnih dneh. V testnih centrih, kjer vzorce pogosto pregledajo neposredno na kraju samem, lahko traja tudi le nekaj ur. Časovni razpon je v veliki meri odvisen od posameznega testnega centra in njegove logistike.
Kljub zapletenim delovnim procesom lahko sodobni laboratoriji izvajajo PCR teste z visoko zmogljivostjo. Pri izvajanju testov pomagajo posebne avtomatizirane naprave.
Kljub temu PCR test velja za sorazmerno »počasno«, a toliko bolj zanesljivo metodo odkrivanja.
Kaj se zgodi, če je rezultat pozitiven?
Če je vzorec odvzet pravilno, pozitiven PCR test pomeni zelo veliko verjetnost, da je testirana oseba okužena s Sars-CoV-2.
Če je bila pri vas s testom PCR potrjena okužba s koronavirusom, bo zavod za javno zdravje prejel obvestilo o pozitivnem rezultatu testa pristojnega laboratorija. V tem primeru zavod za javno zdravje odredi izolacijo ali karanteno.
Ali sem samodejno kužen, če sem pozitiven na testu PCR?
Običajno da. Ampak ne vedno. Rezultat testa PCR je treba vedno razlagati v kontekstu. Pozitiven test pomeni predvsem, da prenašate virusni material.
Včasih je koristen dodatni test protiteles
V takih primerih test na protitelesa zagotavlja gotovost, ki potrjuje veljavnost testa PCR. Najbolje je, da se o tem pogovorite s svojim zdravnikom. Pomagajo vam lahko pri pravilni razlagi rezultata testa PCR.
Kaj storiti, če je rezultat negativen?
Negativen rezultat PCR testa najverjetneje pomeni, da v času odvzema vzorca niste imeli Covid-19 in torej trenutno niste kužni. Lahko pa ste v zgodnji fazi okužbe.
Okužbe s korono je običajno mogoče odkriti šele drugi ali tretji dan po okužbi. Rezultat torej ni prosti prehod. Zato še naprej upoštevajte socialno distanco in higienska pravila ter še naprej nosite masko FFP2 – zaradi lastne zaščite in zaščite drugih.
PCR test za otroke
PCR test za otroke se ne razlikuje od PCR testa za odrasle. Odvzem vzorcev in razlaga rezultatov veljata tako za otroke kot za odrasle.
Kakšna so tveganja PCR testa?
Test PCR ne vključuje fizičnih tveganj. Samo odvzem vzorca z nazofaringealnim brisom nekateri ljudje dojemajo kot moteč ali neprijeten.
Koliko stane test PCR?
Opomba: Če ste se testirali doma in ste dobili pozitiven rezultat, se nemudoma po telefonu naročite pri osebnem zdravniku. Vaš zdravnik se bo z vami po telefonu pogovoril o naslednjih korakih.
Druga možnost je, da pokličete na telefonsko številko 116 117, da se prijavite na PCR test. V idealnem primeru bi morali ostati doma do potrditvenega testa, da zaščitite sebe in druge.
