Patch-clamp tehnika je ime, ki ga dobi elektrofiziološka merilna tehnika. Omogoča merjenje ionskih tokov skozi posamezne kanale znotraj plazemske membrane.
Kaj je tehnika popravljalne objemke?
Tehnika patch clamp ali metoda patch clamp pripada elektrofiziologiji, ki je veja nevrofiziologije, ki se ukvarja z elektrokemičnim prenosom signalov v živčni sistem. S pomočjo te metode je mogoče vizualizirati posamezne ionske kanale v celična membrana telesne celice. To vključuje merjenje tokov nekaj pikoamperov. Tehniko obliža z objemko sta leta 1976 prvič opisala nemški biofizik Erwin Neher in nemški zdravnik Bert Sakmann. Znanstvenika sta leta 1991 prejela Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino za razvoj tehnike objemke. Tako je elektrofiziološke raziskave praktično revolucionirala s tehniko patch-clamp, ker je odprla možnost opazovanja električnega vedenja na membrani beljakovin posameznika molekule. Izraz patch prihaja iz angleškega jezika in pomeni "obliž". Nanaša se na majhen membranski odsek pod obližno pipeto, ki se uporablja kot merilna elektroda. Med postopkom merjenja je membranski obliž pritrjen ali pritrjen (za vpenjanje) na določene potenciale.
Funkcija, učinek in cilji
Tehnika obliž-objemka je elektrofiziološka metoda analize. Temelji na biološkem dejstvu, da imajo celice veliko število por in ionskih kanalov. V notranjosti in zunaj vsake celice se pojavljajo različne koncentracije ali naboji ionov, kar je odvisno od fiziološkega stanja celice. Lipidni dvoplast membrane ni prepusten za vode molekule pa tudi ioni. Kljub temu poteka izmenjava nabitih delcev po celotnem območju celična membrana v nepravilnih intervalih. Razlog za to je napetostna odvisnost ionskih kanalov. Če je dosežen določen membranski potencial, se kanali odprejo po principu "vse ali nič". Tukaj natanko pride tehnika pritrdilne objemke. Na ta način se merilna pipeta pomakne v ionski kanal, ne da bi prodrla skozi celična membrana. Na ta način lahko natančno določimo lokalni električni potencial. Tok uhajanja, ki bi lahko vplival na rezultat merjenja, se običajno lahko izognemo z električno izredno tesnimi povezavami med robom pipete in celično membrano. Metoda pritrdilnih objemk temelji na tehniki napetostne objemke. To tehniko je v tridesetih letih 1930. stoletja razvil ameriški biofizik Kenneth Stewart Cole (1900-1984) za merjenje tokov na živčnih celicah, ki so nedotaknjene. V napetostni objemki poteka vstavitev dveh elektrod v celico, ki zagotavljata ukazno ali zadrževalno napetost. Hkrati se za snemanje tokov, ki se pojavijo čez membrano, uporablja druga elektroda. Če želijo nevrofiziologi vedeti o pretoku električnih tokov skozi določena področja a živčne celice membrano, uporabljajo tehniko patch clamp. Za to uporabljajo fino stekleno pipeto, ki je nameščena na zunanji strani celice. Negativni tlak lahko ustvarimo tako, da ga aspiriramo s pomočjo podkožne brizge. Ta postopek povzroči, da se membrana nekoliko izboči na ustreznem mestu. Negativni tlak zagotavlja, da je steklo pritrjeno na membrano. To povzroči električno izolacijo majhne membranske pege v pipeti od preostale membrane. Za merjenje električnih tokov nevrofiziologi uporabljajo ojačevalnik s patch objemko. To je posebna merilna naprava. V idealnem primeru lahko znanstvenik z napravo pridobi informacije o električnih lastnostih posameznih ionskih kanalov. Ionski kanali uravnavajo na primer dotok in odtok natrijev ioni, ki so pozitivno nabiti, v živčnih celicah. Preiskava poteka na celicah ljudi, rastlin ali živali. Način popravljalne objemke se običajno izvaja na merilni postaji, ki vključuje različne naprave. Na vibracijski merilni mizi je tako imenovana Faradayeva kletka, ki služi kot električni ščit. Poleg tega je na voljo optični mikroskop, vključno z mikromanipulatorjem, s katerim se obližna pipeta postavi v položaj.Poleg tega ima držalo pipete povezavo s predojačevalnikom, medtem ko je nosilec vzorca priključen na elektrodo za kopel. Ojačevalnik z obližnimi objemkami deluje za ojačanje signala predojačevalnika. Na voljo je tudi monitor za opazovanje DUT in pipete za obliž. V večini primerov je za merjenje mize na voljo tudi računalnik in več naprav za shranjevanje podatkov, ki omogočajo digitalno snemanje.
Tveganja, neželeni učinki in nevarnosti
S tehniko obliža z objemko ni nobenih tveganj. Na primer, celice ljudi, živali ali rastlin se pregledujejo šele po odstranitvi. Redko obstaja neomejen dostop do zunanje celične membrane. Iz tega razloga je pogosto treba celice pripraviti na način obliža. Po napolnitvi obližne pipete se vpenja v mikromanipulator. Ta je povezan z ojačevalnikom z obližnimi objemkami in nežno pritisnjen na celico, ki je nedotaknjena. Postopek lahko spremljamo z monitorjem ali mikroskopom. Pod pipeto sedi kos membrane, imenovan membranski obliž. Rahel negativni tlak, ustvarjen na zadnjem koncu pipete, zagotavlja močno povezavo med pipeto in membrano. Rezultat tega postopka je ustvariti električni upor med zunanjo raztopino in notranjostjo pipete več gigaohmov. Znanstveniki se na to sklicujejo tudi kot "gigaseal", ki omogoča doseganje celične konfiguracije metode obliža. Tok, ki teče skozi ionski kanal v obližu, teče tudi skozi vsebino pipete zaradi velike odpornosti na gigaza. Elektroda, priključena na ojačevalnik, je potopljena v raztopino pipete, kar omogoča merjenje aktivnosti posameznih ionskih kanalov znotraj obližne membrane.
