Prosimo, upoštevajte: Naslednji članek je bil vključen v druge običajne terapije, ker ločen odsek še ni na voljo za eksperimentalne metode molekularne biologije zunaj humane medicine. Metoda CRISPR / Cas je molekularno biološka metoda za ciljno rezanje in spreminjanje DNK (urejanje genoma; gen škarje). Leta 1987 so znanstveniki odkrili prej neopaženi adaptivni imunski sistem pri E. coli. Ta temelji na tako imenovanih zaporedjih CRPSPR (redno prepletenih kratkih palindromskih ponovitev) znotraj DNK. E. coli integrira DNA bakteriofagov (skupine virusi ki so specializirani za bakterije kot gostiteljske celice) zaporedje CRSPR lastne DNA, s čimer se transkribira crRNA (prepisovanje DNA v RNA). CrRNA je sestavljena iz distančnih in ponovitvenih zaporedij. Spacer zaporedja so zaporedja, "izvlečena" iz bakterije. Tako imenovana trRNA (tracrRNA) se veže na imenovana ponavljajoča se zaporedja. Zaposluje encim CAS9. Zdaj je prisoten kompleks - kompleks crRNA: tracrRNA: Cas9 - ki je sposoben vezati DNA bakteriofagov, komplementarno vesoljskim sekvencam crRNA. Kot tako imenovana endonukleaza (encim za rezanje DNA, torej restrikcijski encim) CAS9 rezal virusno DNA na dvoverižni način, kar na koncu privede do nezmožnosti replikacije (tj. Brez nadaljnje replikacije in posledično brez nadaljnje integracije). Že več kot desetletje se ta postopek s poudarkom uporablja pri raziskavah urejanja genomov. Opisana "crRNA: tracrRNA: Cas9 kompleks" je splošno uporabna za rastline in živali in omogoča odstranjevanje (brisanje) in končno utišanje genov. Uporaba zunaj raziskav je bila že več kot 5 let ugotovljena v kmetijstvu in živilskih rastlinah za odpornost na sušo in izboljšanje imunizacije proti virusnim patogenom. Postopek bi lahko kasneje uporabili tudi v humani medicini. Od leta 2020 prvič obstaja kurativni terapevtski pristop za bolezen s prirojeno boleznijo srce okvara (vitium) pri otrocih. Vitij je del kompleksne dedne bolezni Noonanov sindrom (avtosomno recesivno ali avtosomno dominantno dedovanje). Po dešifriranju vzročnih variant LZTR1 gen, ustrezna genska korekcija ustvarjenih induciranih pluripotentnih kardiomiocitov (srce mišičnih celic) iz izvornih celic dvojčkov. The gen ureja bistvene signalne poti za diferenciacijo in rast celic.
Pred to potencialno terapijo v humani medicini
Molekularno genetsko testiranje dednih motenj pri starših, vključno s celovitim genetsko svetovanje.
Postopek
Postopek je podoben obrambnemu mehanizmu E. coli, opisanemu v imunski sistem. V tem postopku lahko distančni del crRNA spremenimo tako, da odrežemo zaporedje specifične dvoverižne komplementarne DNA, kar povzroči ciljne delecije. Kemično spremenjena molekula trRNA: crRNA se imenuje vodilna RNA. To zahteva, da se dve različni kompleksi crRNA: tracrRNA: Cas9 pritrdita na dve mesti v DNA. Po odstranitvi fragmenta DNA z ligazami pride do encimske povezave 2. fragmentov DNA. To se razlikuje od samega rezanja zaporedja DNA kot pri bakteriji. Z leti so bile dodane bistvene tehnike modeliranja. Ti omogočajo ne samo delecije znotraj verige DNA, temveč tudi dodajanje (vstavitve) novih nukleotidov DNA. Najbolj obetavna sprememba je glavno urejanje. Tu deleciji in s tem odstranitvi fragmenta DNA sledi vstavitev novega fragmenta DNA. Tako imenovana pegRNA (glavni vodnik za urejanje RNA) je tukaj na voljo kot prepis DNA, ki jo je treba vstaviti. S pomočjo reverzne transkriptaze se pegRNA prepiše v DNA in ponovno vključi v DNA znova z uporabo ligaz. Beljakovine CAS9, potrebne za ta postopek, ustvarijo enoverižne namesto dvoverižnih kosov. To omogoča vstavitev novega fragmenta DNA z natančnim prileganjem v razrezano verigo DNA s štrlečimi konci. Nova sprememba je bistvenega pomena za izmenjavo "patološkega" zaporedja DNA glede na "nepatološko" v prihodnosti v okviru dedne bolezni.
Po terapiji
Ponovno se opravi presejanje genoma, da se potrdi uspeh urejanja genoma.
Možni zapleti
Zaradi možnih osnovnih neskladnosti vodiča RNA se lahko pojavijo neciljni učinki, tj. Vezava na neželenem mestu. Te lahko povzročijo točkovne mutacije (spremembe baze), vstavitve (vključitev dodatnih nukleotidov ali zaporedij DNA v zaporedje DNA), izbris (izguba…), translokacije (sprememba položaja DNA) in inverzije (prisotnost segmenta DNA obrnjena 180 stopinj). Encim CAS9 se v vsakem primeru ne reže na želenem mestu. Povečanje specifičnosti pa je že prišlo do sprememb v zasnovi beljakovin. Tudi s povezovanjem CAS9 na endonukleazo Fokl, prav tako pridobljeno iz bakterije, se lahko specifičnost poveča na 1: 10,000 1 (brez drugih sprememb, samo specifičnost do 2: XNUMX).
